小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。

1.试验所需仪器设备及试剂

      （1）仪器

       CO2细胞培养箱

       荧光倒置显微镜

       高速冷冻离心机

       电热恒温鼓风干燥箱

      （2）试剂耗材

        T25细胞培养瓶

        血球计数板

        细胞培养孔板

        红细胞裂解液

        神经元完全培养基

        0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

        多聚甲醛（PFA）

        DAPI

        Triton X-100

        山羊血清

        NSE

        Goat anti-Rabbit lgG（H+L）

        Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594

        Fluoromount-G荧光封片剂

   2.分离培养方法

        1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，

        2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，

        3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，

        4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，

        5) 过100 μm 滤网，

        6) 收集滤液，300 g离心5 min，

        7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。

       3.免yi荧光

       3.1.实验步骤

     （1）细胞爬片

       取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

     （2）固定

       细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

     （3）破膜封闭

       将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，

       玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，

       取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

     （4）一抗孵育

       一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释

       破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（多可放置一周）

     （5）二抗孵育

      室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

    （6）包埋

      玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。

      鉴定细胞为P1代细胞

3.2.检测结果

   （1）细胞免yi荧光鉴定照片

      （2）检验基本情况：

       经免yi荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。